Validação de ensaios em Análises Clínicas
A validação analítica é um
processo imprescindível para qualquer implantação de um novo equipamento analítico,
teste e/ou metodologia a ser processada em um laboratório. Nos permite uma
completa análise considerando diferentes
amostras, equipamentos de medição, ensaio, métodos e quaisquer outras possíveis
fontes de variação dos processos analíticos. Desta forma, asseguramos a
confiança dos ensaios realizados quanto aos resultados obtidos.
O objetivo de uma validação é
demonstrar ensaios exatos, precisos, estáveis, reprodutíveis e
flexíveis para uma faixa específica de uma substância que
se espera identificar ou quantificar. Em suma, esta validação significa que
iremos garantir que as análises reproduzam valores consistentes se comparadas a
um valor de referência.
Antes do início de uma validação,
é preciso haver um bom planejamento, começando pela segregação das amostras:
Selecione amostras biológicas íntegras:
com volume suficiente, livre de hemólise, lipemia, fibrinas e, nossa sugestão é
que não sejam de pacientes internados ( pois sofrem muita interferência de
medicamentos). Utilizem amostras
conhecidas com resultados baixos, normais e altos do analito que deseja validar
e se não for possível, faça um pool de amostras aleatórias e envie para
comparabilidade em laboratório de Apoio. Se atentem sempre a estabilidade das
mesmas frente ao exame que pretende validar.
Para exames qualitativos,
segregue Reagentes e não Reagentes, Positivos e Negativos. E no caso de
Classificação sanguínea, segregue amostras aleatórias.
Exames de
Coagulação, Hemograma , Microbiologia e Urina, sugerimos utilizar amostras do
dia.
EXECUTANDO A VALIDAÇÃO:
- Segundo o protocolo
do Colégio Americano de Patologia Clínica ( CAP ), a indicação é que a
validação de cada analito seja realizada em 60 ensaios ( 20 resultados baixos,
20 normais e 20 altos ).
Etapas:
De acordo com as
referências pesquisadas, as etapas a seguir são:
-Precisão Intraensaio (Repetibilidade):
A
repetibilidade de resultados corresponde à concordância entre resultados de
sucessivas medidas do mesmo analito, obtidos sob as mesmas condições de medida.
Serão analisadas 10 alíquotas, sequencialmente, de valores baixo, normal e
elevado, em dois períodos distintos, manhã e tarde, de um único dia.
-Precisão Interensaio (Reprodutibilidade):
A
reprodutibilidade é a maior diferença, no nível de confiança de 95%, que pode
ocorrer em resultados obtidos em condições de reprodutibilidade, ou seja,
analistas diferentes, instrumentos diferentes ou até laboratórios diferentes.
Diferente da
Repetibilidade a Reprodutibilidade é a precisão do ensaio em condições mais
variadas e pode ser obtida através de um intralaboratorial, onde analistas
diversos farão os testes em dias diferentes .
A
reprodutibilidade é a maior diferença, no nível de confiança de 95%, que pode
ocorrer em resultados obtidos em condições de reprodutibilidade.
- Sensibilidade Analítica:
É a capacidade
do método de distinguir, com confiança, concentrações mínimas.
Para o
estabelecimento da sensibilidade analítica, serão realizadas 4 diluições (1:2;
1:5; 1:10 e 1:20) de uma amostra de valor baixo. De cada uma das diluições,
serão realizadas 10 determinações. A sensibilidade analítica será definida como
sendo o valor de maior diluição da amostra que apresente resultados
reprodutivos, ou seja, que apresente o menor valor de CV entre os resultados e cujo valor de CV
seja inferior ao CV aceitável para o analito.
-Linearidade Analítica:
É a capacidade
do método em gerar resultados linearmente proporcionais à concentração do
analito, dentro de uma faixa analítica especificada. Para o estabelecimento da
linearidade analítica, serão realizadas 4 diluições (1:2; 1:5; 1:10 e 1:20) de
uma amostra de valor elevado, acima da linearidade preconizada pelo fabricante.
De cada uma das diluições, serão realizadas 10 determinações. A linearidade
analítica será definida como sendo a menor diluição da amostra que apresente
resultados reprodutivos, ou seja, que apresente o menor valor de CV entre os resultados e cujo valor de CV
seja inferior ao CV aceitável para o analito.
-Verificação da Linearidade e Acurácia:
Para a
verificação da linearidade e acurácia, serão selecionadas duas amostras, uma de
valor baixo, próximo à sensibilidade do método e outra de valor elevado,
próximo à linearidade do método. Serão feitas diluições sequenciais das
amostras, de acordo com a tabela abaixo, as quais serão processadas em triplicata
e das quais se obterá um valor médio.
Amostra Diluição Valores Teóricos
Esperados
D1 Amostra baixa pura Concentração conhecida da amostra
D2 4 partes da amostra baixa e 1 parte da
amostra alta (4 x D1) + (1 x D6)/5
D3 3 partes da amostra baixa e 2 partes da
amostra alta (3 x D1) + (2 x D6)/5
D4 2 partes da amostra baixa e 3 partes da
amostra alta (2 x D1) + (3 x D6)/5
D5 1 parte da amostra baixa e 4 partes da
amostra alta ((1 x D1) + (4 x D6)/5
D6 Amostra alta pura Concentração conhecida da amostra
Onde: D 1- D6
correspondem às diferentes diluições.
AMR/CRR:
O Intervalo
Analítico de Medidas (AMR) é definido como o intervalo de concentração no qual
a quantificação da amostra é realizada sem qualquer modificação (diluição ou
concentração).
O Intervalo de
Relato Clínico (CRR) estabelece quais as diluições máximas aplicáveis a cada
analito.
O
estabelecimento do AMR e do CRR se dará através dos resultados obtidos nos
estudos para o estabelecimento da sensibilidade e da linearidade.
-Carryover:
É o carreamento
de resíduo de um ensaio inicial que pode ser levado a outra reação,
contaminando o teste imediatamente seguinte, representando um possível erro
analítico. Para compreender esta fonte de erro nos sistemas analíticos e
garantir que eles estão dentro dos limites permitidos deve-se cumprir um
protocolo de inspeções e verificações periódicas.
No estudo do
carryover serão utilizadas 10 alíquotas
de uma amostra com concentração de valor conhecido baixo(B) e 10 alíquotas de
uma amostra com valor conhecido alto(A), estas amostras serão analisadas
sequencialmente:
1- Três amostras baixas
2- Duas amostras altas
3- Uma amostra baixa
4- Duas amostras altas
5- Quatro amostras baixas
6- Duas amostras altas
7- Uma amostra baixa
8- Duas amostras altas
9- Uma amostra baixa
10- Duas amostras altas
Calculam-se as
médias das concentrações de todas as amostras baixas analisadas após uma
amostra baixa (B-B) e a média das concentrações baixas após amostra alta (A-B).
É ainda calculado o DP das leituras B-B e o carreamento é obtido pela diferença
entre as médias de B-B e A-B.
Como critério
de aceitação adota-se um carreamento de até três desvios padrões das leituras
B-B.
-Robustez:
É a capacidade
do método em resistir a pequenas e deliberadas variações nas condições
analíticas como: condições ambientais, fator humano, variações entre lotes de
reagentes ou materiais empregados. O estudo de robustez será realizado com a
análise de 10 amostras em duplicata por três operadores diferentes
Uma das etapas de Validação é a CORRELAÇÃO CLÍNICA (Valor Diagnóstico ) – Análise aplicada para ensaios de
comparabilidade quantitativa ou qualitativa.
Estes resultados
são analisados em comparação a
Correlação clínica estabelecida entre os resultados dos Analitos em comparabilidade
para validação de exames, métodos, kit, equipamentos e lotes, sendo que os
resultados correlacionados precisam apresentar o mesmo Valor Diagnóstico e
demonstrar conformidade acima do estabelecido para a liberação na produção.
A sua validação inicial neste
caso, deve demonstrar na tabela se os resultados constam dentro da normalidade
ou se representam alterações clínicas.
O cálculo é feito através da
subtração do resultado do equipamento a ser validado com o resultado do
equipamento vigente. A Correlação numérica
entre resultados obtidos para ensaios de Comparabilidade Quantitativas, deve
estar dentro das Normas preconizadas pela ANVISA e INMETRO:
Segue exemplo da planilha de Validação inicial:
CORRELAÇÃO CLÍNICA (Valor Diagnóstico ) - Análise aplicada para ensaios
de comparabilidade Qualitativa:
Os resultados correlacionados precisam apresentar o mesmo Valor
Diagnóstico e demonstrar conformidade acima do estabelecido para a liberação na
produção.
Demonstrar na tabela se os resultados constam dentro da normalidade ou se
representam alterações clínicas.
Para as comparabilidades Qualitativas, utilizar o padrão de Conforme/ Não
conforme.
Antes ou após a validação do analito, deve-se imediatamente cadastrar uma
amostra Teste – e acompanhá-la até a liberação clínica do laudo. Conferir
exames que precisam de cálculo, verificar valor de referência e unidades de
medida.
Imprimir e arquivar datado e assinado pela Garantia da Qualidade, Responsável
Técnico e Tecnologia da Informação (TI). Assegurando assim que o exame será
reproduzido e Inter faceado de ponta a ponta.
Guardar os dados da validação por cinco anos de forma rastreável.
E em caso de implantação, como proceder?
- Verifique se há câmera fria e/ou
geladeiras para guarda de amostras biológicas e outra para guarda de insumos.
-Certifique-se que há fornecimento elétrico que suporte Ar condicionado,
todos os equipamentos ligados e sistema de água com autonomias suficientes no
local.
- Faça um pedido de insumos que contemple o suficiente para a validação (
multiplique o número de testes estimados que fará pelo número de ensaios de
cada kit ) , espelhamento de equipamentos (backup) e primeiro mês de rotina.
Estes itens devem conter o quarteto indispensável para cada analito: Reagente,
Calibrador ,Controle e consumíveis.
Se certifique que os itens acima são compatíveis com a máquina que irá
validar.
- Todas as máquinas devem ter a capacidade de emitirem dados brutos – seja
impresso, via sistema ou pen drive.
POR:
Fábia Bezerra ,
Biomédica, Gerente Nacional de Qualidade da Hapvida Diagnósticos
Mariana M .Zanotto de
Araújo, Biomédica, Supervisora da Qualidade do Grupo São Francisco/Hapvida
Diagnósticos.
REFERÊNCIAS:
.Brasil, Agência Nacional de
Vigilância Sanitária; Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003, Diário
Oficial da União, 02/06/2003.
.Instituto Nacional de Metrologia,
Normalização e Qualidade Industrial; DOQ-CGCRE-008, Orientações sobre Validação
de Métodos de Ensaios Químicos, Março, 2003.
Swartz, M. E.; Krull, I. S.; Pharm.
Technol. 1998, 2012.
Green, J. M.; Anal. Chem. 1996, 68,
305A.
.CLSI GP29-A Métodos alternativos de
controle de Qualidade
.RDC 302 - Regulamento Técnico para
funcionamento de Laboratórios Clínicos
.Westgard Variação Biológica e
especificações de Qualidade Analítca
.www.westgard.com/biodatabase1.htm
.CLIA Proficiency testing criteria for
acceptable analytical performance
.www.westgard.com/clia.htm
. https://www.cap.org/
