Validação Analítica

 

Validação de ensaios em Análises Clínicas

A validação analítica é um processo imprescindível para qualquer implantação de um novo equipamento analítico, teste e/ou metodologia a ser processada em um laboratório. Nos permite uma completa análise  considerando diferentes amostras, equipamentos de medição, ensaio, métodos e quaisquer outras possíveis fontes de variação dos processos analíticos. Desta forma, asseguramos a confiança dos ensaios realizados quanto aos resultados obtidos.

O objetivo de uma validação é demonstrar ensaios exatos, precisos, estáveis, reprodutíveis e

flexíveis para uma faixa específica de uma substância que se espera identificar ou quantificar. Em suma, esta validação significa que iremos garantir que as análises reproduzam valores consistentes se comparadas a um valor de referência.

Antes do início de uma validação, é preciso haver um bom planejamento, começando pela segregação das amostras:

Selecione amostras biológicas íntegras: com volume suficiente, livre de hemólise, lipemia, fibrinas e, nossa sugestão é que não sejam de pacientes internados ( pois sofrem muita interferência de medicamentos).  Utilizem amostras conhecidas com resultados baixos, normais e altos do analito que deseja validar e se não for possível, faça um pool de amostras aleatórias e envie para comparabilidade em laboratório de Apoio. Se atentem sempre a estabilidade das mesmas frente ao exame que pretende validar.

Para exames qualitativos, segregue Reagentes e não Reagentes, Positivos e Negativos. E no caso de Classificação sanguínea, segregue amostras aleatórias.

Exames de Coagulação, Hemograma , Microbiologia e Urina, sugerimos utilizar amostras do dia.

 

EXECUTANDO A VALIDAÇÃO:

- Segundo o protocolo do Colégio Americano de Patologia Clínica ( CAP ), a indicação é que a validação de cada analito seja realizada em 60 ensaios ( 20 resultados baixos, 20 normais e 20 altos ).

 

Etapas:

 

De acordo com as referências pesquisadas, as etapas a seguir são:

 

-Precisão Intraensaio (Repetibilidade):

A repetibilidade de resultados corresponde à concordância entre resultados de sucessivas medidas do mesmo analito, obtidos sob as mesmas condições de medida. Serão analisadas 10 alíquotas, sequencialmente, de valores baixo, normal e elevado, em dois períodos distintos, manhã e tarde, de um único dia.

 

-Precisão Interensaio (Reprodutibilidade):

A reprodutibilidade é a maior diferença, no nível de confiança de 95%, que pode ocorrer em resultados obtidos em condições de reprodutibilidade, ou seja, analistas diferentes, instrumentos diferentes ou até laboratórios diferentes.

Diferente da Repetibilidade a Reprodutibilidade é a precisão do ensaio em condições mais variadas e pode ser obtida através de um intralaboratorial, onde analistas diversos farão os testes em dias diferentes .

A reprodutibilidade é a maior diferença, no nível de confiança de 95%, que pode ocorrer em resultados obtidos em condições de reprodutibilidade.

 

- Sensibilidade Analítica:

É a capacidade do método de distinguir, com confiança, concentrações mínimas.

Para o estabelecimento da sensibilidade analítica, serão realizadas 4 diluições (1:2; 1:5; 1:10 e 1:20) de uma amostra de valor baixo. De cada uma das diluições, serão realizadas 10 determinações. A sensibilidade analítica será definida como sendo o valor de maior diluição da amostra que apresente resultados reprodutivos, ou seja, que apresente o menor valor de  CV entre os resultados e cujo valor de CV seja inferior ao CV aceitável para o analito.

 

-Linearidade Analítica:

É a capacidade do método em gerar resultados linearmente proporcionais à concentração do analito, dentro de uma faixa analítica especificada. Para o estabelecimento da linearidade analítica, serão realizadas 4 diluições (1:2; 1:5; 1:10 e 1:20) de uma amostra de valor elevado, acima da linearidade preconizada pelo fabricante. De cada uma das diluições, serão realizadas 10 determinações. A linearidade analítica será definida como sendo a menor diluição da amostra que apresente resultados reprodutivos, ou seja, que apresente o menor valor de  CV entre os resultados e cujo valor de CV seja inferior ao CV aceitável para o analito.

 

-Verificação da Linearidade e Acurácia:

Para a verificação da linearidade e acurácia, serão selecionadas duas amostras, uma de valor baixo, próximo à sensibilidade do método e outra de valor elevado, próximo à linearidade do método. Serão feitas diluições sequenciais das amostras, de acordo com a tabela abaixo, as quais serão processadas em triplicata e das quais se obterá um valor médio.

Amostra              Diluição              Valores Teóricos    Esperados

D1         Amostra baixa pura       Concentração conhecida da amostra

D2         4 partes da amostra baixa e 1 parte da amostra alta      (4 x D1) + (1 x D6)/5

D3         3 partes da amostra baixa e 2 partes da amostra alta      (3 x D1) + (2 x D6)/5

D4         2 partes da amostra baixa e 3 partes da amostra alta      (2 x D1) + (3 x D6)/5

D5         1 parte da amostra baixa e 4 partes da amostra alta       ((1 x D1) + (4 x D6)/5

D6         Amostra alta pura       Concentração conhecida da amostra

Onde: D 1- D6 correspondem às diferentes diluições.

AMR/CRR:

O Intervalo Analítico de Medidas (AMR) é definido como o intervalo de concentração no qual a quantificação da amostra é realizada sem qualquer modificação (diluição ou concentração).

O Intervalo de Relato Clínico (CRR) estabelece quais as diluições máximas aplicáveis a cada analito.

O estabelecimento do AMR e do CRR se dará através dos resultados obtidos nos estudos para o estabelecimento da sensibilidade e da linearidade.

 

-Carryover:

É o carreamento de resíduo de um ensaio inicial que pode ser levado a outra reação, contaminando o teste imediatamente seguinte, representando um possível erro analítico. Para compreender esta fonte de erro nos sistemas analíticos e garantir que eles estão dentro dos limites permitidos deve-se cumprir um protocolo de inspeções e verificações periódicas.

No estudo do carryover serão utilizadas  10 alíquotas de uma amostra com concentração de valor conhecido baixo(B) e 10 alíquotas de uma amostra com valor conhecido alto(A), estas amostras serão analisadas sequencialmente:

1-          Três amostras baixas

2-          Duas amostras altas

3-          Uma amostra baixa

4-          Duas amostras altas

5-          Quatro amostras baixas

6-          Duas amostras altas

7-          Uma amostra baixa

8-          Duas amostras altas

9-          Uma amostra baixa

10-        Duas amostras altas

 

 

Calculam-se as médias das concentrações de todas as amostras baixas analisadas após uma amostra baixa (B-B) e a média das concentrações baixas após amostra alta (A-B). É ainda calculado o DP das leituras B-B e o carreamento é obtido pela diferença entre as médias de B-B e A-B.

Como critério de aceitação adota-se um carreamento de até três desvios padrões das leituras B-B.

 

-Robustez:

É a capacidade do método em resistir a pequenas e deliberadas variações nas condições analíticas como: condições ambientais, fator humano, variações entre lotes de reagentes ou materiais empregados. O estudo de robustez será realizado com a análise de 10 amostras em duplicata por três operadores diferentes

 

 

 Uma das etapas de Validação é a  CORRELAÇÃO CLÍNICA (Valor Diagnóstico ) –  Análise aplicada para ensaios de comparabilidade quantitativa ou qualitativa.

 Estes  resultados  são analisados em comparação a Correlação clínica estabelecida entre os resultados dos Analitos em comparabilidade para validação de exames, métodos, kit, equipamentos e lotes, sendo que os resultados correlacionados precisam apresentar o mesmo Valor Diagnóstico e demonstrar conformidade acima do estabelecido para a liberação na produção.

A sua validação inicial neste caso, deve demonstrar na tabela se os resultados constam dentro da normalidade ou se representam alterações clínicas.

O cálculo é feito através da subtração do resultado do equipamento a ser validado com o resultado do equipamento vigente. A Correlação numérica entre resultados obtidos para ensaios de Comparabilidade Quantitativas, deve estar dentro das Normas preconizadas pela ANVISA e INMETRO:

Segue exemplo da planilha de Validação inicial:

 

 

CORRELAÇÃO CLÍNICA (Valor Diagnóstico ) - Análise aplicada para ensaios de comparabilidade Qualitativa:

Os resultados correlacionados precisam apresentar o mesmo Valor Diagnóstico e demonstrar conformidade acima do estabelecido para a liberação na produção.

Demonstrar na tabela se os resultados constam dentro da normalidade ou se representam alterações clínicas.

Para as comparabilidades Qualitativas, utilizar o padrão de Conforme/ Não conforme.

Antes ou após a validação do  analito, deve-se imediatamente cadastrar uma amostra Teste – e acompanhá-la até a liberação clínica do laudo. Conferir exames que precisam de cálculo, verificar valor de referência e unidades de medida.

Imprimir e arquivar datado e assinado pela Garantia da Qualidade, Responsável Técnico e Tecnologia da Informação (TI). Assegurando assim que o exame será reproduzido e Inter faceado de ponta a ponta.

Guardar os dados da validação por cinco anos de forma rastreável.

 E em caso de implantação, como proceder?

- Verifique se há câmera fria  e/ou geladeiras para guarda de amostras biológicas e outra para guarda de insumos.

-Certifique-se que há fornecimento elétrico que suporte Ar condicionado, todos os equipamentos ligados e sistema de água com autonomias suficientes no local.

- Faça um pedido de insumos que contemple o suficiente para a validação ( multiplique o número de testes estimados que fará pelo número de ensaios de cada kit ) , espelhamento de equipamentos (backup) e primeiro mês de rotina. Estes itens devem conter o quarteto indispensável para cada analito: Reagente, Calibrador ,Controle e consumíveis.

Se certifique que os itens acima são compatíveis com a máquina que irá validar.

- Todas as máquinas devem ter a capacidade de emitirem dados brutos – seja impresso, via sistema ou pen drive.

 

 

POR:

Fábia Bezerra , Biomédica, Gerente Nacional de Qualidade da Hapvida Diagnósticos

Mariana M .Zanotto de Araújo, Biomédica, Supervisora da Qualidade do Grupo São Francisco/Hapvida Diagnósticos.

 

 

 

 

REFERÊNCIAS:                                                                                                                 

.Brasil, Agência Nacional de Vigilância Sanitária; Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003, Diário Oficial da União, 02/06/2003.                                                                                                                    

.Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial; DOQ-CGCRE-008, Orientações sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos, Março, 2003.                                                               

Swartz, M. E.; Krull, I. S.; Pharm. Technol. 1998, 2012.                                                                                                                      

Green, J. M.; Anal. Chem. 1996, 68, 305A.                                                                                                                          

.CLSI GP29-A Métodos alternativos de controle de Qualidade                                                                                                        

.RDC 302 - Regulamento Técnico para funcionamento de Laboratórios Clínicos                                                       

.Westgard Variação Biológica e especificações de Qualidade Analítca                                                                                        

.www.westgard.com/biodatabase1.htm                                                                                                                          

.CLIA Proficiency testing criteria for acceptable analytical performance                                                                                

.www.westgard.com/clia.htm

. https://www.cap.org/